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透過紫外可見光光譜量測葉綠素於食品的分析
前言介紹
葉綠素是一種在植物材料中自然存在的綠色色素。整體結構中包含的高度共軛的卟啉環，使其能夠在紫外可見光譜的紅色區域吸收光能，如圖1所表示。由於能夠到達地球表面的光子跨越可見光到近紅外光譜範圍，並且在約500奈米處有最大光子通量，含有葉綠素等分子的植物能夠吸收更多的入射光子。透過吸收這些光，植物可以進行光合作用，從而為植物提供能量。
圖1. 葉綠素a與葉綠素b的分子結構
由於許多商業可用的食品產品，內含有植物材料或者源自植物，因此可以觀察到不同濃度的葉綠素。葉綠素是一種綠色色素，因此類似菠菜和萵苣等葉菜類食品自然含有一定濃度的葉綠素。然而，這些化合物也可以在種子和提取的油中找到。在某些食品行業中，確認食品產品中的葉綠素濃度是很重要的。例如，在菜籽油中，葉綠素是一種不受歡迎的污染物，因為它不僅改變了油的顏色，還可能參與到不需要的反應中，降低了油的整體品質。在這些情況下，確定葉綠素含量可能至關重要。
自然界中存在多種不同的葉綠素化合物，食品產品中也有類似的多樣化學結構。例如，葉綠素a和葉綠素b在整體卟啉結構中，僅在其中一個吡咯環上存在甲基和醛基的差異，見圖1紅圈處。此外，pheophytin a與葉綠素a類似，但在卟啉環內不含鎂對離子。
葉綠素a比其他形式的葉綠素更普遍，但在許多不同的來源中可以找到不同比例的葉綠素色素。結構上的微小變化，影響了分子的整體共軛性，導致電子結構的差異，因此材料的吸收性質也不同。因此，這些化合物之間，具有不同的紫外可見光吸收光譜，且為一種非破壞性檢測。因此，可藉此光譜技術，用於檢測和定量給定食品產品中的不同葉綠素衍生物。
在這裡，使用了Thermo Scientific™ Evolution™ Pro 紫外光可見光光譜儀，來分析菠菜樣品中提取的葉綠素，以及分析橄欖油和菜籽油樣品中的葉綠素含量。利用所得到的紫外可見光譜與儀器上測量的葉綠素標準進行了比較，並進行了進一步的數學分析以確定葉綠素a和b的濃度。對於菜籽油，葉綠素濃度是根據美國油脂化學家協會（AOCS）的程序進行量化的。
實驗方法
葉綠素標準品製備
葉綠素a和b（分別為Chl a和Chl b）標準品，分別通過將1.0毫克溶解於0.5毫升95 ％乙醇中製備。然後，將每個標準液分別稀釋在二甲基亞碸（DMSO）和80 ％水合丙酮中，使吸收極大值接近1.0。根據UV-vis測量，葉綠素a和葉綠素b標準在兩種溶劑中的最終濃度，分別為13.3 μM（12.0毫克/升）和5.0 μM（4.6毫克/升）。這些濃度用於確保樣品的吸光度，在最長波長峰值下低於1.0。在製備和分析標準時，需要在暗室下執行，以防止材料的光降解。菠菜葉綠素萃取物的製備
取一部分的菠菜葉，在2.0毫升80 ％丙酮的情況下使用研钵和研杵研磨。然後，將混合物轉移到樣品瓶中，並使用2.0毫升80 ％丙酮三次沖洗研钵和研杵。沖洗液也收集到同一個樣品瓶中，總共回收了6.0毫升的菠菜溶液。收集完後，將樣品在Thermo Scientific Sorvall™ ST 16離心機上以2500轉/分的速度，離心10分鐘。然後，倒出溶液以去除殘留的白色/淡綠色固體。使用相同程序再收集了兩次提取物。所用菠菜葉片的重量見表1。
表1. 每個菠菜萃取物樣品的樣品重量和濃度
樣品油於葉綠素分析的製備
選擇了一份橄欖油和一份菜籽油樣品，來進行葉綠素含量分析。這兩個樣品是從當地一家雜貨店購買的，並直接使用。對於確定菜籽油樣品中Chl a的消光系數的實驗中，準備了加入了Chl a標準溶液，其濃度為13.3 μM。每個菜籽油樣品中Chl a的最終濃度，見下表2。對於每個加入了Chl a的菜籽油樣品，收集的吸光度透過減去沒有Chl a的菜籽油的吸收光譜來進行校正。
表2. 每菜籽油樣本中標準葉綠素a的濃度
儀器設備與參數
使用Evolution Pro紫外光可見光光譜儀，收集每個樣品溶液的UV-vis光譜。參數為1.0 nm的光譜帶寬和2 nm的數據間隔，光譜範圍為350 nm至800 nm。量測樣品時，使用1.0 cm光徑長的塑料比色皿。另外使用5.0 cm光徑長的石英比色皿。結果與討論
葉綠素標準品
如前所述，使用 Evolution Pro 量測DMSO 和80％丙酮中 Chl a 和 Chl b 標準溶液的 UV-vis 吸收光譜。從肉眼觀察，兩種溶液都呈現綠色。如圖2所示，兩種葉綠素標準的光譜是獨特的，包括多個吸收極大值。
圖2. 葉綠素a與葉綠素b於80 %水合丙酮與DMSO溶液中的光譜表現
在80％丙酮中，Chl a 的明顯吸收帶位於432 nm和664 nm處。在相同的溶劑中，Chl b 在460 nm和647 nm處有強的吸收峰，如表3所示，其結果與文獻相符。在卟啉中，這些帶分別稱為 B 帶和 Q 帶。Chl b 包含一個醛基團，取代了卟啉結構中一個吡咯環上的甲基基團。這種化學結構的變化影響了化合物的整體電子結構，導致了 Chl a 和 Chl b 之間觀察到的光譜差異。當在 DMSO 中分析 Chl a 和 Chl b 時，可以觀察到一些小的光譜變化，這與文獻一致。
表3. Chl a and Chl b在80％丙酮和二甲基亞碸中觀察到的波長最大值，
以及與溶劑環境變化相關的光譜飄移
首先，對於Chl a和Chl b，當處於較高極性的溶劑中時，吸收峰最大值向紅移（bathochromic）約2.0 nm，如圖2B和表3所呈現。這種溶劑依賴性的移動被稱為溶劑色變，是由於分子的基態或最低能激發態的溶解度不同而引起的，從而改變了電子結構。吸收光譜隨著溶劑極性增加而向紅移，被稱為正溶劑色變，意味著分子在其激發態時比在基態時更極性化，因此更穩定。激發態的穩定會使激發態能量降低得更多，比基態更多，導致基態和激發態之間的能量差更小，對應著較長波長的吸收峰。
其次，Chl a 和 Chl b 的摩爾吸光係數/消光係數（ε）也受到所使用溶劑的影響。隨著溶劑極性的增加，Chl a的ε增加，而 Chl b的ε則降低。ε反映了基態和激發態之間的躍遷概率。較高的ε與電子被提升到激發態的機率較高相關。這意味著當處於更極性的溶劑中時，如DMSO，Chl a的躍遷機率更高。對於Chl b，在溶劑極性增加時，躍遷概率較低。根據比爾定律，濃度（c）與給定路徑長度（l）中的ε成正比，如方程式 1 所示。
由於峰值位置和ε均受溶劑環境影響，因此在使用比爾定律定量綠葉素樣品時，確保使用正確的ε非常重要。
葉綠素分析—菠菜樣品
如前所述，葉綠素可以在大多數食品樣品中找到，包括菠菜葉。先前已經對菠菜葉進行了葉綠素的檢測和定量分析，結果顯示菠菜葉中含有相當高濃度的葉綠素。因此，菠菜被選為一個模型系統，以展示利用UV-vis光譜學分析食品樣品中葉綠素含量的能力。透過之前概述的程序，從菠菜葉中提取的提取物被收集並使用Evolution Pro光譜儀進行分析。圖3A顯示了來自菠菜提取物的UV-vis光譜。在665 nm和432 nm處發現了明顯的吸收極大值，類似於葉綠素a的吸收光譜。
圖3.
(A) 菠菜萃取物黑色光譜和擬合由葉綠素a和b紅色光譜的線性組合組成。
(B) 透過從兩者的擬合值相減後計算出相減的紫外-可見光光譜。
菠菜萃取物的溶劑，以及用於建構擬合的葉綠素 a 和 b 樣品是 80% 丙酮。
然而，提取的葉綠素光譜與葉綠素a的光譜並不完全匹配，暗示存在其他吸收劑。根據文獻，提取的菠菜樣品還含有一定量的葉綠素b，以及其他類似葉綠素的色素（例如：類胡蘿蔔素）。方程式2表示含有多個成分的溶液的吸收譜，可以表示為每個存在成分的吸收的線性組合。
因此，可以使用葉綠素a和葉綠素b譜的線性組合來擬合提取的葉綠素譜，進而確定每個成分的濃度。對於菠菜提取物樣品，收集到的UV-vis光譜被擬合到方程式3中。其中，Aspinach(λ)表示作為波長函數的菠菜提取物的吸收，Achl a(λ)表示作為波長函數的12.0 mg/L葉綠素a標準的吸收，Achl b(λ)表示作為波長函數的4.6 mg/L葉綠素b標準的吸收，而b和c是擬合參數。擬合參數b和c被允許在600至700 nm之間變化，直到擬合譜在此波長範圍內優化。
從擬合中，確定了葉綠素a和葉綠素b的平均濃度，並在表4中進行了報告。由於每個測量樣品在提取過程中使用的菠菜量不同，因此結果已經歸一化，以反應每單位菠菜質量中葉綠素a或b的存在量，如表4所示。
表4. 平均葉綠素a和b濃度以測定擬合程序和文獻方程式
根據文獻，葉綠素a和葉綠素b組分的濃度也可以通過方程式4和5進行估算，其中[Chl a]和[Chl b]分別是Chl a和Chl b的濃度，以μg/L為單位，A664是664 nm處的吸光度，A647是647 nm處的吸光度。這些方程考慮了在分析波長下來自Chl a和Chl b的貢獻，以避免對每個相應的葉綠素色素的真實濃度進行過度估計。如前所述，葉綠素的ε取決於溶劑。
因此，方程式4和5中使用的值，僅適用於分散在80%丙酮中的樣品。上述方程式被用來確定菠菜提取物樣品中Chl a和Chl b的濃度，並返回與透過擬合確定的值相似的值如表4。圖4為這些方程使用Insight Pro軟體進行自動化的畫面，以限制所需的後續測量分析量。
圖4. Insight Pro軟體客製化計算畫面
儘管菠菜提取物在600 nm至700 nm的光譜區域的吸收與擬合函數密切匹配，但在較短波長的吸收方面則不匹配。這個結果意味著，在提取樣品中存在其他成分。為了更好地確定這些額外的吸收劑的身份，通過從測得的UV-Vis光譜中減去擬合函數來收集差異光譜。由於吸收是所有吸收劑的線性組合，因此從測得光譜中去除由Chl a和Chl b引起的吸收，可以用於估算剩餘吸收性化合物的吸收光譜。圖3B包括所獲得的差異光譜，顯著地在448 nm和474 nm處有窄帶。已知類胡蘿蔔素，如β-胡蘿蔔素和葉黃素，會在400 nm至500 nm之間吸收，其最大值接近450 nm和470 nm。然而，這些額外的類胡蘿蔔素的確切識別超出了本研究的範圍，但這些結果表明，從菠菜葉中提取了其他類胡蘿蔔素，這是可以預期的。
葉綠素分析—油樣品
葉綠素也可以在各種植物油中發現，包括橄欖油和菜籽油。對於橄欖油來說，葉綠素及其相關衍生物質使得橄欖油呈現綠色。如圖5所示，一份特級初榨橄欖油樣品的吸收光譜在420 nm、456 nm、484 nm和670 nm處有吸收極大值，且與文獻相符。對於橄欖油來說，吸收主要不是來自於葉綠素a或b，而是主要來自於葉綠素衍生物質，即不含Mg+的葉綠素分子。然而，從圖5中看來，菜籽油在相同光徑長度下的吸收光譜並不相似，這意味著在此實驗中分析的菜籽油已經處理過，將葉綠素去除。
圖5. 菜籽油黑色光譜和橄欖油粉紅色光譜的紫外-可見光光譜
與橄欖油不同，菜籽油中存在葉綠素可能表示產品品質較低，因為當暴露在室溫或陽光下時，葉綠素可能阻礙氫化反應並促進氧化。此外，葉綠素會將產品染成綠色，這是產品不希望看到的。比如菜籽油產品中，仍然需要測定經過精製後產品中葉綠素的含量，以確保產品的品質。AOCS已經制定了一種用於測定精製油中葉綠素含量的光譜法為方法Cc 13d-55，透過在5公分光徑長的比色皿中測量精製油的吸收光譜。
在這裡，使用5公分光徑長的石英比色皿，測量了一份菜籽油樣品的光譜，以根據該方法量化剩餘的葉綠素含量。如圖6所示，正如預期的那樣，在紅色光譜區域中沒有觀察到顯著的特徵。為了確認菜籽油樣品中葉綠素含量很少，採用了AOCS方法Cc 15d-55的修改版本。該程序利用了比爾定律的原則，其中如果知道吸收、消光系數和光路長，就可以確定濃度。正如之前描述的那樣，由於ε取決於溶劑，因此需要實驗確定菜籽油中Chl a的消光係數。
圖6. 不同光徑下的菜籽油紫外-可見光光譜
製作了四個不同的菜籽油樣品，每個樣品都添加了不同濃度的Chl a標準溶液。使用Chl a是因為這是植物產品中最常見的葉綠素形式。每個測量的樣品中的紅色吸收峰值都發現在666 nm。如表5所示，確定在666 nm處的平均ε為0.11 ± 0.01 ppm-1 cm-1。
表5. 菜籽油中葉綠素a的吸光度和計算的消光係數。
樣品是在1.0 cm光徑的比色皿中測量。
現在已知ε值，可以使用AOCS方法Cc 13d-55中包含的修改版本的計算方法來量化葉綠素含量。由於吸收峰值從AOCS中概述的670 nm移位到666 nm，因此使用方程式6進行計算。
其中[Chl]是以ppm為單位的總葉綠素濃度，A666、A706和A626分別是在666 nm、706 nm和626 nm處測得的吸收度，ε666是在666 nm處的消光係數，而l是所使用的光徑。使用這個方程式6，估算的濃度為0.01 ppm。這個值很低，可以將Chl a的濃度視為可忽略不計。由於這個樣品來自一家超市，預計其中的葉綠素含量很低，因為在商業上可用的菜籽油中，經過精製後其葉綠素含量變很少。
實驗結論
UV-vis吸收光譜方法，是一種針對特徵波長與分析物濃度之間，可以建立線性關係，用來定量樣品濃度，並且為非破壞性的量測。在這裡，Evolution Pro UV-vis光譜儀被用來分析食品樣品中的葉綠素含量。不僅可以分析葉綠素濃度，還可以區分不同的葉綠素衍生物，包括Chl a和Chl b。通過計算和擬合程序，確認了菠菜提取物中Chl a和Chl b的濃度，展示了這種分析的多種不同方法。在油樣品中，UV-vis吸收測量被用來識別商業可用的橄欖油樣品中葉綠素衍生物的存在。這些衍生物賦予了油的特有的綠或黃色調。相反地，該技術能夠確認在菜籽油中葉綠素的含量非常低。