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魚肝油中維生素A的分析：用於衍生物的紫外線-可見光光譜技術
前言介紹
UV-Visible吸收光譜學是一種非常有用的分析技術，最常用於對給定溶液樣品中的分析物進行定量。該方法圍繞分子在電磁光譜的UV-Visible區域吸收光線的能力，這可以引起分子在基態和激發態之間的電子躍遷。由於電子結構及其相關的躍遷機率是特定於指定分子的，所以測得的吸收光譜將提供特定於感興趣的分析物的訊息。透過比爾定律的方程式1，其中A是作為波長函數的測得吸光度，c是分析物的濃度，l是光徑長，ε是作為波長函數的消光系數，測得的吸收被顯示為與分析物濃度呈線性比例。這使得進行簡單快速的定量分析成為可能。
UV-Visible吸收帶通常由於多種因素而寬廣，因此在溶液中存在多種色素時可能會很難解釋，如圖1所示。雖然比爾定律描述了吸光度與單一色素濃度之間的相關性，但當在單個樣品中測量多個色素時，所得的吸收光譜是加性的。方程式2描述了測得吸光度與每個色素吸收之間的關係，其中AT,λ是總吸光度，A1,λ，A 2,λ和An,λ分別是與每個個體成分相關的吸收。對於具有顯著光譜重疊的樣品，確定每個色素的貢獻可能會很困難，或者在主成分分析的情況下，可能需要一定程度的數學擬合和固有估計。
圖1. 由黑色光譜擬合計算出綠色及橘色光譜
為了克服這些缺點，可以採用微分光譜學作為分析複雜系統UV-Visible光譜的方法。在這種方法中，對收集的UV-Visible光譜進行一次微分或是二次微分的計算，並將其作為波長的函數繪製。這些得到的光譜可以幫助更好地解析重疊的光譜特徵，並應用於各種應用領域，如食品科學或製藥分析。雖然以前需要透過像是波長調制等複雜的實驗程序來獲得，但現代軟體能夠快速進行微分光譜的數學計算，而無需進行額外的計算。
一次微分的光譜表示吸光度隨波長變化的情況，將包括正向和負向的特徵，見圖2a所示。對於包含單個分析物且沒有重疊吸收特徵的樣品進行分析時，將存在一個在dA/dλ = 0的拐點。這個拐點指示了溶液中存在的吸收物種的吸收最大值λmax的位置。
圖2. (a)一次微分後的光譜 (b)二次微分後的光譜
在複雜的樣品中，一次微分的光譜會更加錯綜複雜，通常不會包含在 dA/dλ = 0 的拐點。在這種情況下，確定準確的拐點可能很困難，特別是如果重疊的吸收帶比較弱的情況下。為了克服這個問題，可以改用二次微分的光譜，如圖2b所示。透過這種分析，極小值對應於每個吸收最大值λmax的位置，相對來說更容易進行辨別，從而使複雜樣品的定性分析更加迅速。
需要注意的是，雖然微分分析有助於確定重疊吸收帶的相應λmax，但這種分析並不能完全糾正重疊的效應。如圖2所示，較弱帶的λmax可能與真實的λmax稍有偏移。這種偏移是由於殘留的重疊吸收造成的，在這種形式的微分分析中可以預期到。儘管微分光譜學可以幫助定性分析，但也有方法可以定量分析微分光譜。這些定量方法通常利用一次微分，因為根據方程式3，計算得到的一次微分與濃度成正比，因此可以簡化分析方法。
典型的吸收方法在開發標準曲線時使用吸收最大值作為分析波長。然而，對於微分光譜來說，這更加困難。由於λmax與一次微分光譜中的拐點相關，因此在濃度變化時不應觀察到拐點的變化，這意味著需要採用替代的分析方法。
文獻中常引用的分析方法包括切線法、峰值-峰值法、零交叉法和比率法等。在這些例子中，峰值-峰值法、切線法和零交叉法都被使用，儘管計算方法略有不同，透過一個線性函數，用以建立一個將計算數量與分析物濃度相關聯的標準曲線。然而，比率法則使用感興趣的分析物的負峰值和正峰值的比值作為樣品和適當標準之間的比較點。這種分析不提供濃度，而是作為一種檢查，用於確定測量吸收光譜中是否存在背景干擾。
為了演示對複雜樣品進行微分光譜分析的用途，我們對一種常見的補充品-鱈魚肝油中的維生素A含量進行了分析。鱈魚肝油不僅含有可觀的維生素A含量，也稱為視網醇，分子結構化學式如圖3所示，也還可能含有各種其他物質，包括維生素D異構體。視網醇已知在紫外-可見光範圍內吸收，而同時鱈魚肝油中其他一些成分也具有吸收性，並且在與視網醇相同的光譜區域內具有吸收特徵。因此，鱈魚肝油的紫外-可見光吸收光譜預計會包含重疊的吸收特徵。
圖3. Retinol 的分子結構化學式
使用Thermo Scientific™ Evolution™ One Plus 分光光度計，收集了鱈魚肝油樣品和視網醇標準溶液的吸收光譜。然後，使用Thermo Scientific™ Insight™ Pro 軟體進一步處理所得數據，以獲得一次和二次微分光譜。這些結果光譜隨後被用於對鱈魚肝油中的維生素A含量進行定性和定量分析。
實驗設計
將22.4毫克全反式視網醇，以下簡稱為視網醇，溶解在15毫升無水乙醇中製備了視網醇標準樣品。使用文獻中定義的消光系數為52,770 M-1 cm-1，得出了該標準溶液的濃度為3.69 mM 視網醇。在這些實驗中分析的視網醇樣品濃度為29.5 μM。為製備鱈魚肝油原液，將1.0毫升的鱈魚肝油稀釋在49.0毫升的無水乙醇中。然後，通過將鱈魚肝油原液稀釋一半來準備樣品。為了進行標準曲線分析，使用乙醇將事先準備的濃度不同的五種維生素A標準溶液，濃度範圍從4.56-36.5 USP units/g，進行稀釋。採用相同的標準曲線，對前述的同一份鱈魚肝油樣品進行了分析。獲得的濃度用於回算原始鱈魚肝油庫存溶液的濃度。對所有樣品使用Evolution One Plus儀器進行了UV-Visible吸收測量。採用0.5 秒積分時間、1.0 nm帶寬和1.0 nm間隔，光譜範圍為200 nm-500 nm。所有樣品均放置在光徑長1.0 cm的石英比色皿中。使用Insight Pro軟體，如圖4所示。利用Savitsky-Golay濾波器，3個點，二次多項式，計算了所有樣品的一次和二次微分光譜。
圖4. Insight Pro軟體微分光譜設定的畫面
結果與討論
圖5包括維生素A標準retinol和魚肝油的UV-Visible光譜，以便進行比較。 retinol的光譜在325 nm處具有峰值λmax，與文獻報告一致，同時還在311 nm 處有一個小的肩峰特徵。魚肝油樣品觀察到三個最大值分別在285 nm、304 nm 和319 nm。假設319 nm和304 nm處的峰值代表溶液中存在的維生素A含量，由於存在以285 nm為中心的次級吸收特徵，稍微藍移了約6 nm。這個次級特徵來自魚肝油中存在的另一個色固體。眾所周知，魚油中存在維生素D異構體，並在接近此帶的區域吸收。因此，可以推測 285 nm 處的吸收來自維生素D異構體，但其確切識別說明，並非本篇文章討論的主題。
圖5. Retinol(紅色)及Cod Liver Oil(藍色)的UV-VIS光譜
正如前面所述，重疊的色固體的存在可以使吸收光譜發生偏移，從而使準確識別變得困難。為了更準確地確定魚肝油中的峰值位置，對維生素 A 和魚肝油分別計算了一次微分和二次微分光譜，見圖6。對於兩個樣品的一次微分光譜，如圖 6中的藍色線，與文獻相匹配，包括多個拐點。然而，這些拐點的確切位置，很難通過肉眼找到λmax。因此，還計算了每個樣品的二次微分光譜，並用於更好地比較維生素A和魚肝油的λmax位置。
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圖6. Retinol及Cod Liver Oil一次微分(藍色)處理光譜與二次微分後的光譜(紅色)
在304 nm和318 nm的極小值相對於維生素A二次微分光譜中觀察到的極小值有部分藍移。然而，這兩個波段的波長位置的差異是一致的，約為14-15 nm。這表明藍移是由於來自重疊色固體吸收的一些殘留影響所致。當比較純標準的吸收光譜與包含其他吸收化合物的吸收光譜時，這是可以預料的。總的來說，這些結果進一步支持這個證據，即這個光譜特徵與魚肝油中的維生素 A 含量有關。
在微分光譜分析中顯示的吸收極大值的偏移表明樣品中的次級吸收物的貢獻是顯著的。這種貢獻可能足夠大，以至於使用傳統吸收技術對維生素 A含量進行定量分析將不夠。相反，微分光譜學可以用於更好地量化維生素A的濃度，並避免過度估計，這是在處理多成分樣品時的一個常見問題。
圖7a包括了五個濃度不同的維生素A標準樣品的一次微分光譜。正如預期的那樣，隨著維生素A濃度的增加，正負特徵的振幅也會增加。從這組數據中，應用了切線法來建立標準曲線。該方法需要一條切線連接感興趣的極小值周圍的局部最大值，對於維生素A樣品是346 nm。
圖7. (a)不同濃度的全反式維生素A的一次微分光譜。
實線為一次微分光譜，虛線為使用感興趣最小值兩側的相對最大值外推的切線。
(b)“a”與維生素A濃度的標準曲線。樣品均使用 1 cm石英比色皿測量。
然後，從感興趣的極小值到切線線之間畫一條線，如圖8所示。對於每個樣品濃度，重複此過程。此線的大小，在圖8 中標為“a”，用於制定標準曲線，並已證明與分析物濃度的變化呈線性關係。
圖8. Tangent Method圖
標準曲線顯示了“a”與維生素 A 濃度的關係，如圖 7b 所示，如預期地與一條直線相符。對於鱈魚肝油樣品，採用了相同的切線法來確定“a”。在圖 6b中顯示的一次微分光譜中，使用351 nm 的最小值，找到了“a”值為 0.023。利用建立的標準曲線，見圖7b，計算出鱈魚肝油中的“a”值，並校正稀釋因子後，發現原鱈魚肝油樣品中的維生素A濃度為 1410 USP unit/g。根據鱈魚肝油的規格表，預計維生素 A 濃度應為 ≥1383 USP unit/g，與使用一次微分光譜計算結果相符，僅有1.9%的差異。
當實施傳統的標準曲線方法時，即以峰值最大吸收率作為分析物濃度的函數報告時，在鱈魚肝油中得到的維生素A濃度為1550 USP unit/g。該值與預期結果相差 11.7%，進一步突顯了在存在顯著光譜重疊的複雜樣品中可能存在的過度估計問題。
結論
透過本應用文章敘述的實驗，利用UV-Visible微分光譜學，我們成功地確定了鱈魚肝油中維生素A的含量，這是一種由多個色素團組成的複雜樣本。在Evolution One Plus UV-VIS光譜儀上收集了測量數據，並在Insight Pro軟體中輕鬆地轉換為相應的一次和二次微分光譜。通過使用微分光譜學，我們能夠避免由重疊吸收帶引起的複雜性，並且發現維生素A的濃度與預期的濃度相符。儘管這種分析方法存在一定的局限性，但本應用文章描述的結果證明了微分光譜學的實用性和易用性。